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Legionella pneumophila après marquage par un anticorps fluorescent. Exemple d'un marquage rouge.
© Ph. Lebaron - UMR 7621 |
Des chercheurs du CNRS, de l'Université Pierre et Marie Curie, de l'Inserm et de la division Recherche et développement d'EDF ont développé une nouvelle méthode de détection des légionelles, en moins de quatre heures, sans passer par la mise en culture des bactéries. La bactérie Legionella pneumophila, repérée par un marqueur fluorescent spécifique de l'espèce recherchée, est détectée et dénombrée par une technique originale de cytométrie. Cette étude est détaillée dans le numéro de mars de la revue américaine "Applied Environmental Microbiology".
Les légionelles sont des germes présents dans l'environnement. L'une de ses espèces, Legionella pneumophila, est pathogène et regroupe différents sérotypes. Le sérotype le plus abondant, couramment rencontré, est le sérotype 1. C'est celui qui a provoqué l'épidémie mortelle dans le Pas-de-Calais en décembre 2003. La prolifération de la bactérie pose problème, notamment dans les environnements à température élevée (jusqu'à 50-55°C) comme les installations d'eau chaude, les ballons cumulus, les tours réfrigérées avec des aérosols chauds rejetés, les climatisations, les filières à eaux chaudes des hôpitaux. Or, trois à dix jours sont nécessaires pour établir un diagnostic à légionelles par les méthodes classiques qui reposent sur la mise en culture des germes.
Pour les scientifiques, l'enjeu était de développer une nouvelle méthode de détection plus performante et rapide, à l'échelle de la cellule, par cytométrie[
1]. Il y a trois ans, Philippe Lebaron, responsable du laboratoire de microbiologie à l'Observatoire Océanologique de Banyuls (CNRS – Université Pierre et Marie curie, Paris 6) avait contribué au développement d'une technique de “cytométrie en phase solide” reposant sur la détection rapide et sensible de microorganismes rendus fluorescents, en collaboration avec Chemunex, société française de biotechnologie spécialisée dans la détection rapide de contaminations microbiennes[
2]. Lorsque des bactéries sont recherchées dans l'eau, elles sont dans un premier temps concentrées sur une membrane filtrante puis rendues fluorescentes à l'aide d'une sonde. Malheureusement, les techniques microscopiques classiques ne permettent pas de détecter les bactéries lorsqu'elles sont peu nombreuses. Elles ne sont donc pas adaptées à la détection de bactéries pathogènes qui seraient présentes en faible concentration dans l'eau. Le « cytomètre en phase solide » développé par Chemunex permet de pallier cet inconvénient en balayant la surface de la membrane et en détectant une seule bactérie en quelques minutes. EDF a initié en 2000 un programme de recherche[
3] pour appliquer la même technique de détection rapide à la légionelle associant également le Centre national de référence des légionella (CNRL) à Lyon, dirigé par Jérôme Etienne (Equipe Inserm 230 « Pathogénie des staphylocoques », Lyon).
Leur travail a consisté à trouver un marqueur spécifique de l'espèce recherchée (un anticorps hautement spécifique a été utilisé). Ce marqueur est une sonde à laquelle est attaché un fluorochrome qui rend la bactérie fluorescente lorsque la sonde se fixe sur la bactérie. Lors de l'analyse d'un échantillon d'eau, les cellules bactériennes sont concentrées sur une membrane filtrante, rendues fluorescentes à l'aide du marqueur puis le cytomètre détecte et compte les cellules fluorescentes.
La méthode développée a été validée sur des eaux propres de différents hôpitaux de la région lyonnaise en partenariat avec le CNRL et permet de quantifier les légionelles en moins de quatre heures. Cependant, elle ne permet pas de savoir si les bactéries détectées sont mortes ou vivantes. C'est pourquoi les chercheurs travaillent actuellement sur le développement d'un deuxième marquage fluorescent pour différencier les cellules vivantes.
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[1] La cytométrie regroupe l'ensemble des techniques qui permettent d'observer et de mesurer des caractéristiques morphologiques, physiologiques à l'échelle de la cellule. La plupart de ces techniques reposent sur un examen microscopique. La cytométrie en phase solide permet d'observer les cellules sur un support solide et à l'aide d'un balayage laser de détecter la fluorescence.
[2] CNRS info n° 388 de décembre 2000
[3] terminé en octobre 2003
Références :
"Rapid Detection and Enumeration of Legionella pneumophila in Hot Water Systems by Solid-Phase Cytometry", Helena Aurell, Philippe Catala, Pierre Farge, France Wallet, Matthieu Le Brun, Jürgen H. Helbig, Sophie Jarraud, Philippe Lebaron ; "Applied And Environnemental Microbiology", mars 2004, p 1651-1657.
Contacts :
Contact chercheur :
Philippe Lebaron
Observatoire océanologique - Laboratoire d'océanographie biologique de Banyuls
Tél : 04 68 88 73 53
Mél : lebaron@obs-banyuls.fr
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Contacts presse :
Inserm : Séverine Ciancia, tél 01 44 23 60 86 ciancia@tolbiac.inserm.fr
EDF : Matthieu Le Brun, tél 01 30 87 80 59 matthieu.le-brun@edf.fr
CNRS : Magali Sarazin, tél 01 44 96 46 06 magali.sarazin@cnrs-dir.fr
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